PCR技術(shù)是一種基于聚合酶鏈式反應(yīng)原理，用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù)。而熒光PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種更加準確、便捷的檢測方法，在寵物疾病診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。寵物檢測熒光PCR的基本工作原理：
 

　　1.DNA解鏈：在95℃左右的高溫下，DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，解開成為兩條單鏈，這一步是為后續(xù)引物與模板的結(jié)合以及新鏈的合成做準備。
 

　　2.引物結(jié)合：溫度降低到60℃左右時，人工合成的一對特異性引物會分別與DNA單鏈上的特定互補序列相結(jié)合，為DNA聚合酶提供起始點，以便開始合成新的DNA鏈。
 

　　3.延伸合成：當溫度升至72℃左右時，DNA聚合酶以dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)為原料，沿著模板鏈延伸，合成出一條與模板DNA互補的新鏈，從而使目標DNA片段的數(shù)量得到增加。
 

　　4.重復循環(huán)：上述三個步驟不斷重復進行，經(jīng)過多個循環(huán)后，微量的初始DNA片段被大量擴增，使得原本難以檢測的微量DNA變得易于檢測。
 

　　5.熒光信號檢測：在PCR擴增過程中，體系中的熒光基團受到激發(fā)會發(fā)出熒光信號，并且隨著擴增產(chǎn)物的增多，熒光信號也會逐漸增強。通過實時監(jiān)測這些熒光信號的變化情況，就可以確定PCR擴增是否達到了預期的程度，進而判斷樣本中是否存在特定的病原體或基因序列。

 

　　寵物檢測熒光PCR的使用注意事項：
 

　　1.分區(qū)操作
 

　　-嚴格執(zhí)行試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增/產(chǎn)物分析區(qū)的分區(qū)管理。各區(qū)物品嚴禁混用，并在操作前開啟UV燈照射消毒。
 

　　2.防止污染
 

　　-勤換手套，接觸不同區(qū)域或可疑污染源后立即更換新手套；使用帶有濾芯的吸頭以避免交叉污染。
 

　　-禁止用移取PCR產(chǎn)物的移液器接觸試劑或其他關(guān)鍵成分。
 

　　3.試劑保存和使用
 

　　-熒光PCR試劑應(yīng)在冰浴條件下分裝和配制反應(yīng)體系，以保持活性。反復凍融會導致酶活性下降，因此應(yīng)盡量避免。
 

　　-不同批號的試劑不宜混合使用，且需按照說明書要求的順序加入試劑。
 

　　4.樣品處理
 

　　-為防止RNA降解，樣品處理應(yīng)在低溫環(huán)境下進行，并且盡快完成操作。
 

　　-組織樣品需經(jīng)過研磨、離心等步驟提取核酸，全血樣本則需待血凝固后取血清進行處理。